Evaluasi In Vitro terhadap Kemampuan Isolate Bakteri Asam Laktat Asal Air Susu Ibu untuk Mengasimilasikan Kolesterol dan Mendekonjugasikan Garam Empedu.

Judul jurnal : Evaluasi In Vitro terhadap Kemampuan Isolate Bakteri Asam Laktat Asal Air Susu  Ibu  untuk Mengasimilasikan Kolesterol dan Mendekonjugasikan Garam Empedu.
Pendahuluan
                        Telah adanya hasil penelitian yang menyatakan bahwa beberapa bakteri asam laktat (BAL) dapat menurunkan kolesterol secara in vitro maupun invivo. Pengujian pada subjek yang hiperlipidemik dari konsumsi probiotik adalah penurunan kadar kolesterol, sedangkan pada subjek normal, terjadi penurunan trigliserida. Analisa penulis jurnal bahwa pengaruh laktobasili terhadap penurunan kolesterol di duga karena kemampuanya dalam mengasimilasi kolesterol dalam usus halus dan mendekonjugasi garam empedu. Adanya penelitian-penelitian sebelumnya tentang isolate BAL dari ASI yang menunjukkan ketahanan yang baik terhadap asam dan atau garam empedu, yang telah masuk criteria dijadikan sebagai produk probiotik
                        Tujuan penelitian dalam jurnal ini adalah menguji kemampuan isolate BAL untuk mengasimilasi kolesterol dan mendekonjugasi garam empedu berupa natrium taurokolat asal ASI dan menguji ketahanan isolate – isolate tersebut terhadap asam dan garam empedu.
Metodologi
            Bahan dan alat
                        Sebanyak 13 BAL isolate ASI (ASI dai koleksi SEAFAST center IPB), yang terdiri dari 11 isolat Pediococcus, 1 isolat Leuconostoc, dan 1 isolat Lactobacillus. Bahan – bahan kimia yang digunakan yaitu mediun cair dan medium agar de Mann Rogosa Sharpe (MRSB dam MRSA) (Oxoid), akuades, natrium tioglikolat (sigma), kolesterol murni 95% (sigma), oxgall (Merck), etanol (Merck), 2-propanaol (Merck), KOH (Merck), n-heksana (Merck), gas nitrogen, asam asetat glacial (Merck), 0-ftalaldehiad (Sigma), H2SO4 pekat (Merck), NaCl (Merck), HCl 37% (Merck). Alat-alat yang digunakan yaitu gelas laboratorium, timbangan, vortex, refrigerator, spektrofotometer,Shimadzu 2450, sentrifus berpendingin, incubator, penangas air, otoklaf, dan perlengkapan laboratorim lainya.
            Uji ketahanan terhadap pH rendah
                        1% kultur yang telah disegarkan dalam MRSB selama 24 jam diinokulasikan kedalam MRSB dengan HCL 37% untuk didapat pH 2, kemudian diinkubasi 5Jam selama 37 0C. pada awal dann akhir inkubasi, jumlah total BAL dihitung dengan metode hitungan cawan pada media MRSA. Semakin banyak penurunan jumlah sel setelah inkubasi maka semakin tidak tahan bakteri tersebut terhadap pH rendah.
            Uji ketahanan terhadap garam empedu.
                        Sebanyak 1% kultur yang telah disegarkan dalam MRSB selam 24 jam ditumbuhkan dalam media MRSB mengandung 0,5% oxgall, diinkubasi 24 jam suhu 37 0C. pada awal dan akhir inkubasi, dihitung jumlah total BAL dengan metode cawan pada media MRSA. Semakin banyak penurunan jumlah sel stelah inkubasi maka semakin tidak tahan bakteri tersebut terhadap garam empedu.
            Uji asimilasi kolesterol secara In Vitro
                        Digunakan 2-propanol untuk melarutkan kolesterol. MRRSB ditambah larutan kolesterol steril (2,5mg/ml dalam 2-propanol) sehingga konsentrasi akhir kolesterol dalam broth 95 ug/ml. 10 ml larutan tersebut diinokulasi 100ul kultur BAL dan diinkubasi 37 0C selama 20 jam. Setelah inkubasi, sel dipisahkan dari larutan dengan sentrifugasi pada 12000 x g dan suhu 4 0C selama 10 menit. Kemudian dianalisis jumlah kolesterol yang diasimilasi pada media uji dengan media control (media yang tidak diinokulasi dengan kulturr) berdasrkan metode modifikasi Gilliland et al (1985) yang prinsipnya dengan modifikasi jumlah supernatan yang dianalisis menjadi dua kali lipat. Kemudian warna yang terbentuk diukur pada panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna berbanding lurus dengan konsentrasi kolesterol.
            Uji dekonjugasi natrium taurokolat
                        Natrium taurokolat digunakan sebagai asam empedu terkonjugasi. Pengujian ini menggunakan medium cair MRS yg disuplementasikan 0,2% natrium tioglikolat dan 0,2% natrium taurokolat. Medium cair tersebut diinokulasikan kultur BAL 1% dan diinkubasi 37 0C 24 jam dan dianalisis jumlah asam kolat bebas. Analisis asam kolat bebas dengan cara 20 ml kultur diatur pH pada 7 dg NaOh 1N. Volumenya ditepatkan 25ml dengan akuades dan disentrifugasipada 12000 x g selama 10 menit suh 1 0C untuk memisahkan sel. 15 ml supernatan dijadikan pH 1 dengan HCl 10N dan dijadikan 24 ml dengan akuades. Diambil 3ml sampel dan 9ml etil asetat 99,5% yang dicampur rata dan dibiarkan sampai terjadi pemisahan fase. 3ml lapisan etil asetat diambil dan dievaporasikan sampai kering pada suhu 60 0C dengan aliran gas nitrogen.ditambah 1ml NaOH 0,1 N. 6ml 16N H2SO4 dan 1ml furfuraldehid dicampur rata. Kemudian dipanaskan pada suhu 65 0C selam 13 menit. Setelah dingin ditambah 5ml asam asetat glacial dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660nm dengan spektrofotometer. Konsentrasi asam kolat bebas ditentukan dengan kurva standar.
Hasil dan Pembahasan
            Ketahanan BAL Isolat ASI terhadap pH rendah
                        Semua isolate mengalami penurunan jumlah sel setelah inkubasi selama 5 jam pada pH 2. Niali penurunan tersebut berbeda untuk setiap isolate dengan kisaran penurunan 0,57-7,24 log cfu/ml. Hanya isolate Leuconostocyang mengalami penurunan jumlah sel krang dari 1 unit log (paling tahan), hal ini menunjukkan kemampuan untuk bertahan pada kondisi asam berbeda setiap isolat. Nilai ini berbeda nyata (p<0,05) dg nilai perubahan jumlah sel pada isolate lainya berdasrkan hasil analisis statistic. Hal ini dimungkinkan karena perbedaan membrane sitoplasma setiap bakteri. Menurut Cotter dan Hill (2003) menyatakan bahwa beberapa BAL dapat menginduksi respon toleransi asam terhadap perlakuan asam yang ringan.
            Ketahanan BAL isolate ASI terhadap garam empedu
                        Pada 13 isolate bakteri dari ASI  yang ditumbuhkan pada media yang mengandung garam empedu (0,5% oxgall), sebanyak 6 isolat mengalami penambahan jumlah sel pasca inkubasi 24 jam dengan kisaran 0,22-0,32 log cfu/ml dan 7 isolat lainya mengalami penurunan jumlah sel dengan kisaran 0,01-0,22 log cfu/ml. isolate Pediococcus pentosaceus 2-A16 merupakan isolate yang ketahanannya paling tinggi terhadap garam empedu dibandingkan dengan isolate lainya berdasarkan analisis statistic dengan penambahan jumlah sel sebesar 0,32 log cfu/ml, tetapi hal tersebut menunjukkan tidak berbeda nyata (p>0,05) dengan penambahan jumlah isolate lima jenis isolate lainya.
                        Cairan empedu merupakan campuran dari asam empedu, kolesterol, asam lemak, fosfolipid, pigmen empedu, dan sejumlah xenobiotik terdetoksifikasi. Laporan Kimoto-Nira (2007) melaporkan bahwa terdapat hubungan antara komposisi asam lemak setiap bakteri dengan kemampuanya untuk dapat bertahan terhadap garam empedu. Hal inilah yang mungkin menjadi penyebab perbedaan ketahanan pada bakteri-bakteri tersebut.
            Asimilasi kolesterol
                        Tujuan dilakukan asimilasi kolesterol untuk menyeleksi kultur yang akan dikembangkan sebagai probiotik penurun kolesterol dengan diadaptasikan padamedia tumbuh yang diformulasikan mengandung garam empedu agar kultur mampu mengambil kolesterol dari medium pertumbuhan setara dengan jumlah garam empedu yang secara normal terdapat didalam usus.
                        Hasil dari ketiga belas isolate ASI yang diuji memiliki kemampuan untuk mengasimilasi kolesterol secara in vitro dengan kisaran jumlah kolesterol yang diasimilasi oleh setiap kultur sebesr 0,86-14,97 ug/ml. Hasil uji menunjukkan bahwa keragaman aktivitas asimilasi kolesterol tidak berhubungan dengan perbedaan spesies tertentu akan tetapi bergantung pada msing-masing strain dependent. Hal ini dimungkinkan oleh pengaruh sifat kimia dan structural dari peptidoglikan dinding sel masing-masing strain yang mengandung asam amino yang mampu mengikat kolesterol (Kimoto-Nira et al.,2007).
                        Hasil analisis statistic menunjukkan tidak adanya hubungan yang signifikan (p>0,05) antara kemampuan asimilasi kolesterol dengan ketahanan terhadap garam empedu (koefisien korelasi linier=0,466). Dalam proses asimilasi diduga sebagian kolesterol diambil oleh sel bakteri bergabung dengn membrane seluler bakteri tersebut. Penelitian yang dilakukan Noh et al (1997) mengidensikasikan  bahwa kolesterol telah mengubah dinding sel atau membrane sel lactobacilli sehingga lebih tahan terhadap gangguan sonikasi.
            Dekonjugasi Natrium Taurokolat
                        Dekonjugasi garam empedu oleh enzim bile salt hidrolase (BSH) yang dihasilkan oleh BAL berhubungan dengan penurunan kolesterol dalam darah. Hasil dekonjugasi yang ditunjukkan pada pengukuran absorbanis menunjukkan bahwa isolate-isolat BAL asal ASI hanya memiliki kemampuan dekonjugasi natrium taurokolat (membebaskan asam kolat)  sebesar 0,06-0,25 umol asam klot/ml kultur. Hasil tersebut menunjukkan bahwa isolate BAL asal ASI tergolong lemah. Koefisien korelasi antara kemampuan dekonjugasi natrium taurokolat dengan ketahanan terhadap garam empedu sebesar -0,205 dan tidak ada korelasi antara kemampuan dekonjugasi natrium taurokolat dengan ketahanan terhadap pH rendah (koefisien korelasi linier=-0,190). Hal ini menunjukkan hubungan yang berbanding terbalik antar ketahanan terhadap pH rendahh dan garam empedu.
Kesimpulan
                        Sebanyak 13 isolat BAL asal ASI memiliki ketahanan yang tingi terhadap garam empedu dan memiliki kemampuan untuk mengasimilasi kolesterol pada kisaran 0,86-14,97 ug/ml, tetapai hanya satu yang memiliki ketahanan tinggi terhadap pH rendah. Selain itu isolate BAL asal ASI memiliki daya dekonjugasi natrium taurokolat yang lemah, dengan memebebaskan asam kolat bekisar 0,06-0,25 umol/ml. dari ketigabelas isolate BAL asal ASI yang diuji, Pediococcus pentosaceus 1-A38 merupakan isolate yang paling potensial digunakan pada pengembangan produk probiotik dengan sifat fungsional spesifik untuk menurunkan kolesterol dengan mekanisme asimilasi dan dekonjugasi garam empedu.

Leave a Reply